Revista: Bioquímica del vino
Metabolismo nitrogenado de Saccharomyces cerevisiae durante la fermentación vínica
El proyecto de investigación en Viticultura y Enología (CENIT-DEMETER) tiene como objetivo transversal estudiar el efecto del cambio climático en el sector vitivinícola. Nuestros dos grupos de investigación (IATA y URV) han participado en dicho proyecto con un objetivo global: analizar las necesidades concretas de diferentes levaduras vínicas durante la fermentación alcohólica, así como las fuentes y concentración de nitrógeno más adecuadas para conseguir una buena velocidad fermentativa y una óptima calidad organoléptica de los vinos. A continuación se resumen algunos de los resultados más destacables.
- Albert Mas
- Biotecnología Enológica, Departamento de Bioquímica y Biotecnología Facultad de Enología, Universitat Rovira i Virgili
- Gemma Beltrán
- Biotecnología Enológica, Departamento de Bioquímica y Biotecnología Facultad de Enología, Universitat Rovira i Virgili
- Marta Sancho
- Biotecnología Enológica, Departamento de Bioquímica y Biotecnología Facultad de Enología, Universitat Rovira i Virgili
- Alicia Gutiérrez
- Departamento de Biotecnología de los Alimentos, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Burjassot
- Rosana Chiva
- Departamento de Biotecnología de los Alimentos, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Burjassot
- José Manuel Guillamón
- Biotecnología Enológica, Departamento de Bioquímica y Biotecnología Facultad de Enología, Universitat Rovira i Virgili, Tarragona.
a transformación de la uva en vino es un proceso biotecnológico en el que los microorganismos presentes, fundamentalmente las levaduras, utilizan los nutrientes del mosto para su crecimiento, produciendo una gama de metabolitos que convierten un líquido azucarado en una solución hidroalcohólica de sabor y aroma agradable.
El mosto de uva es un medio muy complejo, con una gran variedad de compuestos que van desde los mayoritarios (azúcares) hasta compuestos en cantidades muy pequeñas pero importantes, tanto desde el punto de vista nutricional (vitaminas, minerales) como organoléptico (aromas y precursores). No obstante, dista mucho de ser un medio de cultivo óptimo, ya que en realidad se convierte en un medio altamente selectivo.
Esta selectividad es consecuencia, por un lado, del elevado contenido en azúcares (presente en concentraciones equimolares de glucosa y fructosa que oscilan entre 170 y 280 g/L, aunque en determinados casos pueden llegar hasta concentraciones muy superiores: concentración por deshidratación, pasificación, ataques de hongos como Botrytis, algunas técnicas enológicas,…) y, por otro, del fuerte desequilibrio con la fracción nitrogenada, con concentraciones 3 órdenes de magnitud inferiores (concentraciones entre 70 y 600 mg/L). Este componente nitrogenado es utilizado por las levaduras para reproducirse (producción de biomasa) durante la fermentación alcohólica y asegurar un número de células suficientes para consumir todos los azúcares del mosto. Por lo tanto, el contenido en nitrógeno condiciona la realización de la fermentación alcohólica, tanto en su velocidad como en su culminación.1 Pero además, la mayoría de las fuentes nitrogenadas del mosto (amonio y aminoácidos) son a su vez precursores aromáticos, determinando igualmente la calidad aromática del vino.
El nitrógeno en el mosto puede estar presente en dos formas claramente diferenciadas: la inorgánica, básicamente como amonio, y la orgánica formada por aminoácidos, péptidos y proteínas. No todas estas formas son igualmente disponibles para la levadura ya que, por ejemplo, los péptidos y las proteínas no se suelen considerar como auténticas fuentes de nitrógeno, y los aminoácidos son muy variables como fuentes nitrogenadas ya que mientras algunos son consumidos ávidamente (glutamina, por ejemplo), otros no lo son en absoluto en condiciones anaerobias, como la prolina. Curiosamente la prolina, junto con la arginina, son los dos aminoácidos mayoritarios en mostos de uva.
El amonio suele ser altamente disponible para las levaduras, por lo que es una forma química que se suele utilizar de forma abundante en la industria enológica. La presencia de nitrógeno en cualquiera de estas formas químicas es fuertemente variable, dependiendo de diversos factores, entre ellos la variedad de uva, su grado de maduración, características edafoclimáticas y diversos aspectos tecnológicos (tipo de vinificación, prensado, etc.). No obstante, y como parte de una estrategia adaptativa a la fermentación del mosto, la levadura vínica Saccharomyces cerevisiae no consume este nitrógeno asimilable de manera aleatoria, sino que tiene un orden de preferencia por las distintas fuentes de nitrógeno. S. cerevisiae ha desarrollado diferentes mecanismos moleculares que le permiten utilizar preferentemente aquellas fuentes que mantienen un mejor crecimiento.
Este mecanismo de selección de la fuente de nitrógeno se conoce como represión catabólica por nitrógeno (NCR).2 La NCR se caracteriza porque la célula es capaz de detectar la presencia de las fuentes de nitrógeno ricas y desencadenar una cadena de señales, que culmina con la activación de los genes implicados en el transporte y metabolismo de estas fuentes ricas y en la represión de aquellos genes implicados en el transporte y utilización de fuentes más pobres. Una vez consumidas las fuentes de nitrógeno más ricas (amonio, glutamina y asparagina), la levadura activa la maquinaria metabólica para la utilización de las más pobres (arginina, glutamato, alanina, etc.).
En el actual contexto de cambio climático, la excesiva maduración de la uva tiene dos consecuencias muy directas en la composición del mosto: el aumento de los azúcares a fermentar y la disminución del contenido nitrogenado. Esto dificulta todavía más si cabe la tarea fermentativa de la levadura y hace muy necesario el conocimiento sobre las necesidades nitrogenadas de las diferentes levaduras vínicas utilizadas en la industria enológica.
En el año 2008 se inició un proyecto de investigación en Viticultura y Enología (CENIT-DEMETER) cuyo objetivo transversal era precisamente el efecto del cambio climático en el sector vitivinícola. Nuestros dos grupos de investigación (IATA y URV) han participado en dicho proyecto con un objetivo global: analizar las necesidades concretas de diferentes levaduras vínicas durante la fermentación alcohólica, así como las fuentes y concentración de nitrógeno más adecuadas para conseguir una buena velocidad fermentativa y una óptima calidad organoléptica de los vinos. A continuación se resumen algunos de los resultados más destacables.
Figura 1. Tasa máxima de crecimiento (µmax) para las distintas cepas comerciales en función de la concentración y la fuente de nitrógeno
Fuente:Gutierrez et al., 2012.

Figura 2. Análisis de componentes principales en función de la fuente y concentración de nitrógeno y los aromas (cepa PDM).
La mayor síntesis de compuestos aromáticos probablemente se relaciona con un mayor consumo de nitrógeno, ya que actúan como precursores de la síntesis de ésteres y regulan su producción.5 Sobre la base de los resultados de estos trabajos, es importante que las células de levaduras dispongan de suficiente nitrógeno para producir la máxima población de células activas durante la fase exponencial de crecimiento. Sin embargo, para mantener una buena vitalidad fermentativa durante la fase estacionaria, es interesante la disponibilidad de nitrógeno durante esta fase, especialmente en forma de nitrógeno orgánico (arginina), que aseguren una finalización correcta de la fermentación y un perfil aromático correcto.

Figura 3. Fermentación alcohólica de un mosto con 280 g/L de azúcar inoculado con la cepa EC1118 en presencia de diferentes fuentes nitrogenadas.
MOC: mezcla orgánica compleja.

Figura 4. Cinética fermentativa de fermentaciones industriales representadas tanto en forma de azúcares residuales finales (mostos bajos en nitrógeno) como en reducción de la densidad del mosto (mostos altos en nitrógeno).
Otro objetivo de este proyecto era el análisis y puesta a punto de diferentes marcadores moleculares y bioquímicos para la detección precoz de carencias nutricionales en las células de levaduras durante la fermentación alcohólica. En concreto, se han ensayado dos marcadores bioquímicos (la acumulación de trehalosa y la actividad del enzima arginasa) y varios marcadores moleculares basados en la actividad de varios genes, cuya expresión viene determinada por la concentración de nitrógeno del medio. Finalmente, hemos refinado y simplificado el sistema mediante la utilización de un reporter o chivato de la carencia de nitrógeno basado en la síntesis de la proteína fluorescente verde (GFP). 7
Figura 5. Actividad fluorescente de las cuatro cepas vínicas. Las cepas están modificadas con la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor de la permeasa general de aminoácidos GAP1, durante la fermentación de dos mostos con diferente concentración de nitrógeno (60 y 140 mg N/L). A la derecha podemos ver diferentes imágenes al microscopio, con campo claro y fluorescencia, de células muestreadas en fermentaciones con tres concentraciones de nitrógeno (60, 140 y 300 mg N/L). Podemos observar el mayor número de células fluorescentes, y de mayor intensidad, cuanto menor es la concentración de nitrógeno.
Fuente: Gutierrez et al., 2012.7
En esta misma figura se puede ver la monitorización de dos fermentaciones con distinta concentración de N (60 y 140 mg N/L) y comprobar el momento exacto en que se produce un aumento de la fluorescencia, y por tanto, de necesidad nutricional de la cepa (fig. 5). La determinación del momento exacto en que las células de levadura detectan carencia de nitrógeno tiene un gran interés industrial porque permite saber al enólogo el momento de la fermentación más conveniente para la suplementación con nitrógeno adicional.
Bibliografía