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Revista: Biología cuántica


Estrategias en la transferencia de electrones de los sistemas biológicos

  • Marta Martínez-Júlvez

  • Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, e Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos. Universidad de Zaragoza.

  • Patricia Ferreira

  • Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, e Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos. Universidad de Zaragoza.

  • Milagros Medina

  • Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, e Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos. Universidad de Zaragoza.

METABOLISMO REDOX Y ECONOMÍA CELULAR

El metabolismo abarca un conjunto de reacciones que implican procesos de óxido-reducción (o redox), donde los electrones fluyen desde un donador (reductor, con potencial de reducción más negativo) a un aceptor (oxidante, con potencial menos negativo). Así, estas reacciones siguen la dirección impuesta por el oxidante y el reductor, siendo los procesos redox siempre exergónicos. Con objeto de aprovechar la energía liberada en estos procesos, los sistemas biológicos cuentan con estrategias que permiten su almacenaje en forma de energía química o en gradiente de concentración y/o carga eléctrica a través de una membrana, así como su utilización en la activación de eventos de señalización celular.

 

Las biomoléculas con actividad redox son fundamentalmente proteínas y enzimas que utilizan como cofactores moléculas orgánicas o átomos/agrupaciones metálicas implicados en procesos de transporte de un único electrón. Entre los cofactores orgánicos se encuentran los nucleótidos de flavina, FAD y FMN, que en flavoproteínas pueden acoplar procesos de dos electrones con aquellos de un solo electrón. El grupo hemo, un cofactor órgano-metálico, está presente en hemoproteínas y cuenta con un átomo de hierro coordinado a un anillo porfirina. 

 

Otros metales, como Fe, Ni, Cu, Mn, Co, o Zn, también actúan como cofactores bien de forma individual o en asociaciones inorgánicas, como los centros sulfo-férricos. Adicionalmente, una serie de moléculas de bajo peso molecular o coenzimas contribuyen a la comunicación redox entre proteínas. Entre ellas destacar: i) los dinucleótidos de adenina y nicotinamida, NAD+ /H y NADP+ /H, transportadores obligados de dos electrones, que almacenan el poder reductor en la célula y contribuyen a su homeostasis redox; y ii) las quinonas liposolubles, transportadores móviles de uno o dos electrones en membranas celulares, y que habitualmente acoplan este transporte con el de iones a través de la bicapa lipídica, generando gradientes electroquímicos.

 

 

En el contexto de la organización celular, los procesos redox se dividen entre aquellos donde la transferencia de electrones ocurre entre cofactores proteicos, y aquellos donde la reacción implica la oxidación o reducción de un sustrato externo. En el primer caso, el transporte de electrones se establece entre cofactores situados en un complejo constituido por varias subunidades proteicas, frecuentemente anclado a una membrana, o entre proteínas solubles que previamente han de acoplarse (Figura 1). Los complejos de membrana, como en las cadenas respiratoria o fotosintética, presentan una organización espacial de cofactores redox que proporciona el entorno, la geometría y la orientación óptimos para maximizar la eficiencia y velocidad del proceso redox, que suele ocurrir en el rango de picosegundos (ps) a femtosegundos (fs). Esta organización evita la disipación de la energía liberada en el proceso redox y permite su almacenamiento en forma de gradiente de concentraciones, de ATP o de NADPH. Si la transferencia de electrones ocurre entre dos proteínas independientes, o interviene un sustrato o coenzima, entonces, ha de tener lugar la formación de un acoplamiento entre las moléculas reaccionantes que aporte una geometría óptima. En este caso, la interacción entre las moléculas reaccionantes ha de ser transitoria, permitiendo la reorganización del acoplamiento inicial para alcanzar la organización más competente para la transferencia de electrones, y la rápida disociación de las moléculas reaccionantes una vez que esta ha tenido lugar. En estas situaciones, la geometría redox suele ser menos eficiente y estos procesos ocurren en escalas de tiempo de milisegundos (ms) a segundos (s).

 

MECANISMOS DE REACCIÓN DE LOS PROCESOS DE ÓXIDO-REDUCCIÓN

Las biomoléculas redox más relevantes son las enzimas tipo oxidorreductasa, capaces de aumentar considerablemente la velocidad de la reacción redox respecto al proceso sin catalizar. Estas enzimas disminuyen la energía de activación sin alterar la constante de equilibrio de la reacción redox y actúan con gran especificidad. Sus ciclos catalíticos se componen de dos semi-reacciones: una de reducción, donde el cofactor redox es reducido al captar los electrones de un donador, y una segunda reacción de oxidación donde el cofactor redox es reoxidado al transferir los electrones a un compuesto aceptor. Las de tipo deshidrogenasa son claves en el metabolismo energético catalizando reacciones reversibles, según las condiciones y necesidades energéticas y biosintéticas de la célula, de sustracción o adición de un átomo de hidrógeno de un sustrato (oxidación o reducción respectivamente) en presencia de coenzimas que actúan como aceptores o donadores. Las de tipo oxidasa, monooxigenasa y peroxidasa, catalizan la oxidación irreversible del sustrato, utilizando como aceptor de electrones el oxígeno molecular (las primeras) o el peróxido de hidrógeno (la última). Estas enzimas juegan papeles centrales en el metabolismo celular como aceptores terminales de electrones en rutas de almacenamiento de energía o en procesos de detoxificación y biosíntesis de diversos metabolitos. 

 

 

Para entender los mecanismos catalíticos y de especificidad de las enzimas se recurre a estudios cinéticos en estado estacionario y pre-estacionario (Figura 2). En estado estacionario, la determinación de la velocidad inicial de la reacción en función de la concentración del sustrato permite el cálculo experimental de tres parámetros cinéticos de gran utilidad: la constante catalítica (kcat o número de recambio), que es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y molécula de enzima; la constante de Michaelis (Km), que con frecuencia tiene un valor similar a la concentración fisiológica del sustrato; y la eficiencia catalítica (kcat/Km) que permite comparar la eficiencia entre diferentes enzimas. Para las oxidorreductasas que catalizan reacciones bisustrato en presencia de un donador y un aceptor de electrones, las velocidades de tales reacciones se pueden analizar globalmente. Esto permite identificar si la enzima y ambos sustratos forman un complejo ternario, o por el contrario el mecanismo es tipo ping-pong o doble desplazamiento. El estudio detallado de las etapas individuales (procesos de asociación y transferencia de electrones) que intervienen en las semirreacciones de reducción y oxidación, así como la determinación de las propiedades de especies intermediarias que pudieran aparecer en el proceso, requieren métodos cinéticos de estado pre-estacionario que permitan medir reacciones extremadamente rápidas. Entre ellos, los equipos de mezcla rápida con flujo detenido acoplados a un sistema de detección espectrofotométrico permiten obtener datos en un marco temporal de ms a s. Si las reacciones son más rápidas, se requiere del empleo de metodologías de espectrometría cinética inducida por pulso de láser, que permiten medir procesos entre ms y fs. Este es el caso de muchos procesos redox que tienen lugar entre cofactores proteicos. La combinación de este tipo de estudios cinéticos ha permitido describir el mecanismo catalítico de la enzima aril-alcohol oxidasa de Pleurotus eryngii (Figura 2) como modelo representativo de los miembros de la superfamilia glucosa-metanol-colina oxidorreductasas, con función auxiliar en el proceso de degradación de la lignocelulosa y con potenciales aplicaciones biotecnológicas en la producción de biocombustibles y compuestos de interés biotecnológico. Estos estudios mecanísticos han evidenciado el potencial de esta oxidasa en la producción de bioplásticos a partir de derivados de biomasa vegetal. 

 

CONTRIBUCIONES DINÁMICAS Y CUÁNTICAS EN LOS PROCESOS ENZIMÁTICOS: TRANSFERENCIA ACOPLADA ELECTRÓN-HIDRÓGENO

A pesar del elevado número de enzimas caracterizadas y del interés que tiene el diseño de inhibidores de enzimas y de actividades enzimáticas de novo, los factores que determinan que el centro activo de una enzima sea un eficiente catalizador siguen siendo objeto de estudio. Multitud de caracterizaciones cinéticas han dejado patente que los movimientos de la proteína resultan esenciales en la interacción con los sustratos y los productos, y en la eficiencia catalítica. En gran medida, estas conclusiones se han alcanzado mediante el estudio de los procesos redox, ya que un importante número de reacciones catalizadas por oxidorreductasas implican procesos de ruptura de un enlace C-H. En estos casos, los electrones se pueden transferir en forma de un ion hidruro (:H- ) o acoplados a átomos de hidrógeno o protones. Esto conlleva que las etapas químicas de la catálisis puedan ser dominadas por un componente cuántico que permite a la partícula atravesar la barrera energética sin superar la Energía de activación (Ea) (Figura 3). Este fenómeno se conoce como efecto túnel; aumenta la velocidad de transferencia de la partícula y está influenciado por la dinámica del centro activo. Así, cualquier perturbación en la dinámica proteica tiene efecto en su eficiencia, y debe ser considerada en el diseño de las herramientas biotecnológicas basadas en enzimas. 

 

 

Los modelos actualmente empleados para comprender la transferencia de hidrógeno catalizada por enzimas incorporan túnel cuántico y al menos dos tipos de movimientos dinámicos de la proteína: pre-organización (o muestreo conformacional) y reorganización. Los movimientos de pre-organización ocurren en el rango en el rango temporal de ns-ps y afectan a regiones alejadas del centro activo. Las dinámicas de reorganización suceden por fluctuaciones ultra rápidas (fs-ps) de los átomos pesados que conforman el sitio activo, y se clasifican en: pasiva o reorganización ambiental, y activa o gating (Figura 4). Las dinámicas pasivas se producen por movimientos de los átomos pesados y, aunque no modulan activamente la probabilidad de túnel, aumentan la probabilidad de alcanzar una conformación que lo permita. Este es el comportamiento general de las enzimas nativas con sitios activos aparentemente optimizados evolutivamente. Esta optimización les confiere una eficiencia catalítica adaptada a las condiciones fisiológicas y de homeostasis metabólica en las que ejercen su función. Por otro lado, las dinámicas activas, o muestreo de la distancia donador-aceptor (DAD sampling), influyen directamente sobre el túnel. Este comportamiento se observa al producirse perturbaciones en la dinámica del sito activo, bien por la introducción de mutaciones o por someter el proceso a condiciones no óptimas de temperatura. En este caso, se requiere el muestreo de la distancia donador-aceptor para que se produzca la transferencia. En resumen, estos modelos proponen que las enzimas nativas tienen tendencia a cursar con efecto túnel y a minimizar los movimientos de gating, utilizando una dinámica pasiva para atravesar la barrera energética. 

 

 

El desarrollo y la aplicación de estos modelos se basan en la evaluación de las contribuciones dinámicas y cuánticas mediante el estudio de la dependencia relativa de las velocidades de reacción para la transferencia de isótopos de hidrógeno (H) y deuterio (D), desde, o, a un sustrato determinado, con la temperatura. El H y el D presentan propiedades diferenciales que modulan su potencial de transferencia (Figura 3). La Ea para la transferencia de H (EaH) es menor que para D (EaD), ya que la energía de punto cero (ZPE) es más elevada para el átomo más ligero, aumentando así la velocidad de reacción relativa para H. Además, la probabilidad relativa del H de ser transferido mediante túnel en una parte más ancha de la barrera es mayor, porque su longitud de onda es mayor y más próxima a la distancia de transferencia. Estas diferencias de energía se pueden cuantificar mediante lo que se conoce como efecto isotópico cinético (KIE) o cociente entre las velocidades de transferencia de los dos isótopos, KIEHD=kH / kD , visualizando el incremento en la velocidad de reacción del isótopo más ligero debido al túnel. El KIE es particularmente significativo en los isótopos de H/D, ya que los átomos de H son livianos y tienen la mitad de la masa que los D. La evaluación de la dependencia de la temperatura, tanto de las velocidades para cada isótopo como del KIE en el contexto de la ecuación de Arrhenius, en particular las representaciones lnk vs 1/T y lnKIE vs 1/T , permiten determinar la participación de los procesos cuánticos y dinámicos en el proceso (Figura 4). Para las enzimas nativas que catalizan los procesos de transferencia de hidrógeno con túnel, los movimientos de reorganización nucleares son suficientes para llevar a los átomos donador-aceptor a una conformación de túnel óptima, sin compresión de sus coordenadas, y por tanto sus KIE son independientes de la temperatura. Pero cuando el centro activo no está optimizado, aparece una dependencia del KIE con la temperatura que potencia el muestreo de la distancia donador-aceptor (Figura 4).

 

La asociación de estos comportamientos cinéticos con los movimientos proteicos específicos a nivel estructural es también relevante. Su estudio experimental es complejo, pero se puede abordar mediante aproximaciones de biología computacional. Estos métodos pueden proporcionar una aproximación a la conformación estructural del estado de transición (ET), difícil de abordar de forma experimental. La forma más precisa de evaluar la energía del proceso catalítico requiere el uso de la mecánica cuántica (QM). Aunque dicha metodología resulta todavía inviable para el tratamiento de sistemas tan complejos como las proteínas, se han desarrollado métodos híbridos QM/ MM que permiten considerar todos los aspectos del sistema de estudio. Estos métodos dividen el sistema en un subsistema QM, que incluye los átomos implicados en la reacción, y un subsistema basado en mecánica molecular (MM), que incluye el resto de los átomos. El subsistema MM perturba así la parte QM mediante interacciones electrostáticas y de van der Waals, haciendo computacionalmente viable el considerar la dinámica proteica, mientras que la subregión QM evalúa la etapa reactiva. Los métodos QM/MM analizan los potenciales caminos de reacción y las estructuras por las que una enzima transita en el paso de reactivos a productos, pasando por el ET, e incluyen la complejidad adicional que representan los efectos cuánticos. Así, proporcionan la barrera de energía libre de reacción, y permiten elucidar mecanismos de reacción y configuraciones del sistema QM a lo largo de la coordenada de reacción elegida, incluyendo reactivos, ET y productos (Figura 3).  

 

 

Como ejemplo, mencionar que la combinación de estas metodologías en la caracterización de la transferencia de hidruro entre NADP+ /H y las ferredoxina NADP+ reductasas (FNR) ha permitido concluir que este proceso sucede con una contribución de efecto túnel modulado dinámicamente de manera diferente en las distintas clases de esta familia de reductasas. Así, se ha podido describir cómo en las enzimas bacterianas, más antiguas evolutivamente, se ha alcanzado una optimización de los sitios activos que minimiza la contribución de gating, mientras que en las enzimas plastídicas, más recientes comparadas con las bacterianas, y más eficientes en términos de catálisis, el proceso está modulado por DAD sampling. El enfoque QM/MM en este sistema ha proporcionado además sutiles detalles estructurales y mecanísticos en estas enzimas, explicando el papel fundamental que ejercen algunos aminoácidos del centro activo durante la catálisis. 

 

PARA LEER MÁS

Banerjee R, Becker DF, Dickman MB, Gladyshev VN, Ragsdale SW. “Redox Biochemistry” ISBN:9780470177334. John Wiley & Sons, Inc. (2008).

Nagel ZD, Klinman JP. “A 21st century revisionist’s view at a turning point in enzymology”. Nat Chem Biol 5 (2009) 543-50.

Ferreira P, Hernández-Ortega A, Herguedas B, Martínez AT, Medina M. “Aryl-alcohol oxidase involved in lignin degradation: a mechanistic study based on steady and pre-steady state kinetics and primary and solvent isotope effects with two alcohol substrates”. J Biol Chem 284 (2009) 24840-7.

Carro J, Fernández-Fueyo E, Fernández-Alonso C, Cañada J, Ullrich R, Hofrichter M, Alcalde M, Ferreira P, Martínez AT. “Self-sustained enzymatic cascade for the production of 2,5-furandicarboxylic acid from 5-methoxymethylfurfural”. Biotechnol Biofuels 11 (2018) 86.

Lans I, Medina M, Rosta E, Hummer G, García-Viloca M, Lluch JM, González-Lafont À. “Theoretical study of the mechanism of the hydride ransfer between Ferredoxin NADP+ Reductase and NADP+ : The Role of Tyr303”. J Am Chem Soc. 134 (2012) 20544-53. l Sánchez-Azqueta A, Catalano-Dupuy DL, López-Rivero A, Tondo ML, Orellano EG, Ceccarelli EA, Medina M. “Dynamics of the active site architecture in plant-type ferredoxin NADP+ reductases catalytic complexes”. Biochimica et Biophysica Acta 1837 (2014) 1730–8.

 


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