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Seraseq®, herramientas de validación para ensayos de NGS

La consolidación de las herramientas de secuenciación masiva (Next Generation Sequencing, NGS) como plataforma de diagnóstico clínico para la investigación ha permitido el desarrollo de la medicina personalizada. De hecho, los paneles de NGS se han convertido en un elemento fundamental para el diagnóstico de enfermedades atribuibles a la presencia de alteraciones genéticas. Para las pruebas clínicas, la alta sensibilidad y especificidad de los resultados de NGS son esenciales, ya que los médicos basan en estos datos la selección de tratamiento.


 

En la mayoría de laboratorios clínicos, los paneles de NGS se han implementado como método de diagnóstico rutinario por ser una técnica con una ratio efectividad/coste muy elevada. Sin embargo, no hay que olvidar que toda técnica tiene su limitación, y estos paneles no son la excepción. El cuello de botella de la secuenciación se encuentra en el límite de detección de las frecuencias de las variantes alélicas (variant allele frequency, VAF) que suele oscilar entre el 5-10%1 . A pesar de que para la mayoría de las aplicaciones de secuenciación una sensibilidad de mutación del 5% de VAF es suficiente, en algunos casos, como la identificación de mutaciones subclonales de resistencia a fármacos del tejido tumoral o la realización de perfiles tumorales no invasivos con ADN libre de células de muestras de sangre periférica (biopsia líquida), esta sensibilidad no es suficiente2,3. Para estas aplicaciones solo se puede lograr una alta sensibilidad clínica cuando la sensibilidad a la mutación del panel NGS alcanza una VAF del 0,1% al 0,5%. Y para confirmar una mutación al 0,1% de VAF de forma fiable, se necesita secuenciar con una profundidad muy elevada. Esto supondría un incremento sustancial del coste de dicha secuenciación que sería muy difícil de asumir por las unidades de diagnóstico. Asimismo, los paneles de NGS son susceptibles de tener una alta tasa de falsos positivos causados no solo por la limitación de la profundidad de la secuenciación, sino por el error intrínseco de NGS, la no uniformidad de la cobertura de genes y los errores del software de llamada (calling) de variantes4 o el propio proceso de obtención del material genético. 

 

 

La mayoría de los protocolos recomiendan la secuenciación Sanger para validar las mutaciones con bajo VAF; sin embargo, se ha demostrado que la proporción de variantes falsas positivas puede ser de hasta el 78% para las variantes de un solo nucleótido (SNV) y del 44% para las pequeñas inserciones y deleciones (INDELS) tras la validación de las mutaciones por Sanger detectadas en los paneles de NGS5 . Esto ocurre porque la secuenciación Sanger tiene un límite de detección del 5-20% de VAF, por lo que no debería usarse como único método de validación de las variantes encontradas con VAF <5%6

 

Estos datos dejan patente la necesidad de un método alternativo de confirmación de las variantes encontradas en los paneles de NGS. La gama de productos Seraseq® constituyen una alternativa eficaz para dar solución a estas limitaciones, puesto que es un material de referencia formado por secuencias de material genético biosintético (DNA, RNA) que contienen aquellas alteraciones presentes con baja frecuencia en pacientes (SNVs, INDELS, fusiones y reordenamientos estructurales), pero que son cruciales para la prescripción de tratamiento. Seraseq® se presenta en distintos formatos (FFPE, liquido similar al plasma, DNA/ RNA aislado) para garantizar la estandarización y la validación analítica y clínica de los ensayos de NGS. La variedad de formatos de presentación permite que estos estándares de referencia se puedan manejar de manera idéntica a una muestra de paciente, lo que permite también validar el protocolo de tratamiento previo de la muestra, así como el análisis bioinformático posterior aportando un control positivo de VAF de forma garantizada. Seraseq® ha desarrollado una gama de productos específicos para aquellas áreas donde la validación es más crucial: inmuno-oncología, biopsia líquida, tumor sólido, DNA fetal circulante, enfermedades hereditarias y enfermedades infecciosas, aportando para cada una de las áreas productos que contienen las secuencias de las mutaciones más relevantes con VAF de hasta 0,1%.

 

 

Desde NIMGenetics, empresa con larga trayectoria en el diagnóstico genético, distribuimos en España y Portugal la amplia gama de productos Seraseq® que garantizan el proceso de calidad, minimizan los costes y ahorran tiempo en el flujo de trabajo diario en los ensayos de NGS. Estos controles de referencia, válidos para oncología, medicina reproductiva, enfermedades hereditarias e infecciosas, emplean una tecnología innovadora y patentada que permite producir materiales muy similares a las muestras de pacientes, facilitando con ello los procesos de optimización, validación y monitorización de los ensayos.

 

Más información en www.nimgenetics.com/estudios-geneticos/seracare/

 

REFERENCIAS

1. Yan, Y.H., Chen, S.X., Cheng, L.Y. et al. Confirming putative variants at≤5% allele frequency using allele enrichment and Sanger sequencing. Sci Rep 11, 11640 (2021).

2. Hata, A. N. et al. Tumor cells can follow distinct evolutionary paths to become resistant to epidermal growth factor receptor inhibition. Nat. Med. 22, 262–9 (2016).

3. Cohen, J. D. et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 359, 926–30 (2018).

4. Lier, A. et al. Validating comprehensive next-generation sequencing results for precision oncology: The NCT/DKTK molecularly aided stratification for tumor eradication research experience. JCO Precis. Oncol., 1–13 (2018).

5. Belkadi, A. et al. Whole-genome sequencing is more powerful than whole-exome sequencing for detecting exome variants. Proc. Natl. Acad. Sci USA 112, 5473–78 (2015).

6. Baudhuin, L. M. et al. Confirming variants in next-generation sequencing panel testing by Sanger sequencing. J. Mol. Diagn. 17, 456–61 (2015)

 


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